Полезен ли электрофорез


Физиотерапия электрофорез

Лечение при помощи различных сил природы, или физиотерапия, является одной из старейших областей медицины. Она изучает, как влияют на организм различные природные или созданные искусственно физические факторы и разрабатывает методы и средства их использования для лечения и профилактики различных заболеваний.
Среди основных направлений можно выделить:
• бальнеотерапию, или водолечение
• тепловое лечение;
• лечение путем механических воздействий;
• светолечение;
• электролечение.
Наибольшее число методов включает электролечение. Но, пожалуй, самым распространенным является электрофорез. Он занимает положение на стыке двух областей медицины, таких как физиотерапия и медикаментозное лечение, так как электрический ток используется для доставки в организм лекарственных веществ.

Сущность метода и его преимущества

Лекарственный электрофорез – метод лечения, который сочетает введение в организм определенных веществ с воздействием постоянного или переменного электрического тока. Изобретению такого метода способствовал ряд научных открытий и изобретений конца 18, начала 19 века, таких как гальванический элемент, теория электролитической диссоциации и т.д.
Электрофорезу в медицине нашлось применение с начала 19 века, когда впервые был использован для лечения. С тех пор метод электрофореза постоянно совершенствуется, сфера его использования расширяется. Физиотерапия – основное, но единственное место применения электрофореза. Он используется также в диагностике и биохимических исследованиях.
Электрофорез как способ лечения заключается в том, что между телом и электродом прибора помещается прокладка, смоченная лекарственным раствором. Под воздействием тока ионы вещества из раствора переносятся через протоки кожных желез или через слизистые оболочки в более глубокие ткани. Откуда затем разносятся по всему организму с кровотоком и лимфотоком.
Такой способ введения лекарств имеет ряд вполне очевидных преимуществ, если сравнивать с введением через рот или путем инъекций:
• отсутствует повреждение тканей и болевые ощущения;
• в пищеварительном тракте и крови не возникает лишком высокая концентрация лекарственного вещества, которая может нанести им вред;
• местное введение, при котором большая часть необходимого компонента скапливается непосредственно в области лечения;
• ионы, в виде которых препарат попадает в организм, являются наиболее активной формой вещества;
• длительность эффекта значительно дольше, чем при прочих методах лечения;
• риск возникновения побочных эффектов, напротив, уменьшается.
За все эти качества лекарственный электрофорез заслужил славу одного из самых безопасных консервативных методов лечения. Его эффективность очевидна для врачей, а вот многие пациенты склонны сомневаться, считая, что воздействие электрического тока может нанести вред. Попробуем развеять подобные предубеждения.

Насколько эффективен такой метод лечения

Чтобы понять, в чем заключается эффективность электрофореза, важно знать, какое именно воздействие он оказывает на организм. Оно будет комплексным. Лекарственное вещество, попадая в подкожные ткани, вызывает местный эффект, вступая в реакции обмена веществ.
Накапливаясь в строго определенном участке тела, действующее вещество образует там так называемое депо, откуда после этого оно будет медленно разноситься с током крови или лимфы, воздействуя уже на весь организм в целом. Такой эффект называется гуморальным, или системным.
Да и сам электрический ток оказывает положительное воздействие на ткани и нервную систему. Раздражение кожных рецепторов помогает изменить многие процессы, происходящие в тканях, нормализуя их и вызывая не только положительные изменения в них, но и общую реакцию организма.
Если же говорить о том, какие конкретно эффекты вызывает электрофорез, то можно назвать следующие:
• помогает уменьшить воспалительный процесс, доставляя лекарство непосредственно к поврежденной ткани или очагу воспаления;
• санирует ткани, если воспаление вызвано микробной инфекцией;
• снимает отеки за счет нормализации лимфотока;
• обезболивает, причем как за счет доставки соответствующего препарата, так и по причине уменьшения воспаления или отека, которые могут провоцировать появление боли;
• расширяет кровеносные и лимфатические сосуды, позволяя тканям получать в достаточном количестве питательные вещества и кислород, а также выводить продукты обмена;
• снимает спазмы мускулатуры, в том числе и гладкой внутренних органов, обеспечивая нормальную циркуляцию крови;
• нормализует работу желез внутренней секреции.
Однако, эффективность такой процедуры, как электрофорез будет неодинаковой у всех пациентов. Все это необходимо учитывать врачу, назначая пациенту электрофорез.
Существует ряд закономерностей, соблюдение которых позволит сделать лечение результативным:
• наибольший эффект дает применение растворов с небольшой концентрацией и высокой степенью чистоты;
• в организм попадает не более 10% вещества, нанесенного на прокладку;
• количество введенного вещества напрямую зависит от количества электричества, прошедшего через ткани, а также от размера молекул и заряда ионов;
• чем старше пациент, тем менее проницаема его кожа для лекарств;
• через слизистые оболочки поступает большее количество ионов, чем через кожу;
• не все участки кожи подходят для проведения электрофореза.

Может ли эта процедура быть вредной

Как и любая медицинская манипуляция, электрофорез может нанести вред при несоблюдении противопоказаний к его применению или нарушении техники проведения процедуры. Для того, чтобы исключить подобную ситуацию, нужно следовать указаниям врача и соблюдать все его рекомендации.
Безусловно, электрофорез будет вреден и даже опасен при следующих заболеваниях и состояниях:
• любые злокачественные новообразования, независимо от их расположения;
• почечная и сердечная недостаточность;
• острые заболевания, воспалительные или гнойные;
• повышенная температура тела или лихорадочное состояние;
• некоторые психические заболевания;
• бронхиальная астма;
• заболевания кожи, такие как экзема и дерматит;
• атеросклероз, гипертония и некоторые другие патологии сосудов;
• склонность к возникновению кровотечений;
• нарушение свертываемости крови;
• ранки, ссадины или другие повреждения кожи в местах проведения процедуры;
• изменение чувствительности кожи.
К числу противопоказаний для электрофореза относят также беременность и период менструации. Но иногда такая процедура не приносит вред, а напротив служит для предупреждения преждевременных родов или снятия сильной боли. Но решение о том, стоит ли назначать электрофорез в подобной ситуации решает только врач, опираясь на полную информацию о здоровье пациентки.
Для беременных женщин есть и дополнительные противопоказания для проведения электрофореза:
• тошнота и рвота, вызванные токсикозом;
• состояние плода, препятствующее процедуре
• патологии почек;
• высокий риск кровотечений;
• эклампсия.

К чему ведет несоблюдение техники проведения процедуры

Как бы не была безопасна физиотерапия, не стоит забывать, что электрический ток, даже такой слабый, который использует лекарственный электрофорез, явление достаточно опасное. И несоблюдение мер безопасности и рекомендаций по проведению сеанса может привести к печальным последствиям. Одним из них является ожог от электрофореза.
Одной из причин его появления является соприкосновение кожи непосредственно с электродом. Для того, чтобы не допустить подобного повреждения используются специальные прокладки. Они изготавливаются из нескольких слоев гидрофильного материала, чаще всего для этой цели используют белую фланель.
Размер прокладки должен быть больше, чем поверхность электрода. Она должна выступать за его края не менее, чем на сантиметр. Назначение такой прокладки не только не допустить ожога, но и снизить сопротивление кожи, обеспечить наилучший контакт между ней и электродом.
Прокладка смачивается раствором лекарственного средства или дистиллированной водой, в зависимости от того, как проводится процедура, и помещается на кожу. Жидкость должна быть теплой, чтобы вызвать расширение пор кожи. После этого на ней располагается электрод. При накладывании электрода необходимо внимательно следить, чтобы он не выступал за края прокладки и не соприкасался с кожей.
Проводя электрофорез необходимо контролировать силу тока и те ощущения, которые испытывает пациент. Допускается легкое покалывание, но нельзя доводить до жжения и боли. Это может стать второй причиной появления ожога. Если такие ощущения появились, необходимо отключить ток и выяснить причину появления столь сильной реакции.

Другие причины негативной реакции

Как правило, побочные эффекты, возникающие после процедуры, связаны с индивидуальной непереносимостью вводимого лекарственного вещества или электрического тока. Об этом стоит сообщить врачу заранее, иначе вред от такой процедуры будет значительно больше, чем ожидаемая польза.
Аллергическая реакция на препарат может быть довольно серьезной. Непереносимость электрического ока проявляется, чаще всего, в появлении кожной сыпи. Иногда наличие такой реакции выявляется уже после проведения процедуры. В этом случае необходимо прекратить сеансы и выбрать другой способ лечения.
У маленьких детей электрофорез может вызывать различные реакции, в том числе он могут стать более нервными, раздражительными, начать плакать. Это может быть связано не столько с самой процедурой, сколько в непривычной пугающей обстановкой. Но в любом случае, при появлении такой реакции о целесообразности дальнейших процедур лучше посоветоваться с врачом.
Иногда электрофорез может вызывать боли после проведения процедуры. Но такое явление тоже, как правило, связано с непереносимостью препарата. Или с обострением заболевания, которое может быть спровоцировано процедурой. В подобном случае также необходима консультация врача.
В целом же, несмотря на подобные индивидуальные проявления, электрофорез является одним из самых безопасных и малотравматичных способов лечения и профилактики многих заболеваний, травм и патологий развития. Для минимизации любых возможных неблагоприятных последствий необходимо соблюдать рекомендации врача, правила безопасного обращения с электроприборами и требования гигиены.

Что такое гель-электрофорез? | Факты

Электрофорез - это метод, обычно используемый в лаборатории для разделения заряженных молекул, таких как ДНК, по размеру.

  • Гель-электрофорез - это метод, обычно используемый в лабораториях для разделения заряженных молекул, таких как ДНК, РНК и белки, в зависимости от их размера.
  • Заряженные молекулы движутся через гель, когда через него пропускают электрический ток.
  • Через гель пропускают электрический ток, так что один конец геля имеет положительный заряд, а другой конец - отрицательный.
  • Движение заряженных молекул называется миграцией. Молекулы движутся навстречу противоположному заряду. Таким образом, молекула с отрицательным зарядом будет тянуться к положительному концу (противоположности притягиваются!).
  • Гель состоит из проницаемой матрицы, немного похожей на сито, через которую молекулы могут перемещаться при прохождении электрического тока.
  • Более мелкие молекулы мигрируют через гель быстрее и, следовательно, перемещаются дальше, чем более крупные фрагменты, которые мигрируют медленнее и, следовательно, будут перемещаться на меньшее расстояние.В результате молекулы разделяются по размеру.

Гель-электрофорез и ДНК

  • Электрофорез позволяет различать фрагменты ДНК разной длины.
  • ДНК заряжена отрицательно, поэтому при приложении электрического тока к гелю ДНК будет перемещаться к положительно заряженному электроду.
  • Более короткие нити ДНК проходят через гель быстрее, чем более длинные нити, в результате чего фрагменты располагаются по размеру.
  • Использование красителей, флуоресцентных меток или радиоактивных меток позволяет видеть ДНК на геле после их разделения. Они появятся на геле в виде полос.
  • Маркер ДНК с фрагментами известной длины обычно пропускается через гель одновременно с образцами.
  • Сравнивая полосы образцов ДНК с полосами на маркере ДНК, вы можете определить приблизительную длину фрагментов ДНК в образцах.

Как проводится гель-электрофорез?

Подготовка геля

  • Гели агарозы обычно используются для визуализации фрагментов ДНК.Концентрация агарозы, используемой для приготовления геля, зависит от размера фрагментов ДНК, с которыми вы работаете.
  • Чем выше концентрация агарозы, тем плотнее матрица и наоборот. Меньшие фрагменты ДНК разделяются при более высоких концентрациях агарозы, в то время как более крупные молекулы требуют более низкой концентрации агарозы.
  • Для получения геля порошок агарозы смешивают с буфером для электрофореза и нагревают до высокой температуры до тех пор, пока весь порошок агарозы не расплавится.
  • Расплавленный гель затем выливают в лоток для отливки геля, и на одном конце помещают «гребешок», чтобы сделать лунки для образца, в который будет помещаться пипетка.
  • Когда гель остынет и затвердеет (теперь он будет непрозрачным, а не прозрачным), гребешок удаляется.
  • Многие люди сейчас используют готовые гели.
  • Затем гель помещают в емкость для электрофореза, и буфер для электрофореза наливают в емкость до тех пор, пока поверхность геля не будет покрыта. Буфер проводит электрический ток.Тип используемого буфера зависит от приблизительного размера фрагментов ДНК в образце.

Подготовка ДНК к электрофорезу

  • Краситель добавляется к образцу ДНК перед электрофорезом, чтобы увеличить вязкость образца, что предотвратит его выплытие из лунок и так, чтобы миграция образца через гель видно.
  • Маркер ДНК (также известный как стандарт размера или лестница ДНК) загружается в первую лунку геля.Фрагменты в маркере имеют известную длину, поэтому их можно использовать для приблизительного определения размера фрагментов в образцах.
  • Подготовленные образцы ДНК затем пипеткой переносятся в оставшиеся лунки геля.
  • Когда это будет сделано, крышка помещается на резервуар для электрофореза, чтобы убедиться, что ориентация геля, положительного и отрицательного электродов правильная (мы хотим, чтобы ДНК перемещалась по гелю к положительному концу).

Разделение фрагментов

  • Затем включается электрический ток, так что отрицательно заряженная ДНК движется через гель к положительной стороне геля.
  • Более короткие участки ДНК перемещаются быстрее, чем более длинные, поэтому перемещайтесь дальше во время прохождения тока.
  • Расстояние, на которое ДНК мигрировала в геле, можно определить визуально, наблюдая за миграцией красителя загрузочного буфера.
  • Электрический ток остается включенным достаточно долго, чтобы гарантировать, что фрагменты ДНК перемещаются по гелю достаточно далеко, чтобы разделить их, но не настолько долго, чтобы они стекали с конца геля.

Иллюстрация оборудования для электрофореза ДНК, используемого для разделения фрагментов ДНК по размеру.Гель находится в резервуаре с буфером. Образцы ДНК помещают в лунки на одном конце геля, и через гель пропускают электрический ток. Отрицательно заряженная ДНК движется к положительному электроду. Изображение предоставлено: Genome Research Limited

Визуализация результатов

  • После того, как ДНК прошла достаточно далеко по гелю, электрический ток отключается и гель удаляется из электрофореза.
  • Для визуализации ДНК гель окрашивают флуоресцентным красителем, который связывается с ДНК, и помещают на ультрафиолетовый трансиллюминатор, который показывает окрашенную ДНК в виде ярких полос.
  • В качестве альтернативы краситель можно смешать с гелем перед его заливкой.
  • Если гель растекся правильно, будет видна полосатая структура маркера ДНК / стандарта размера.
  • Затем можно судить о размере ДНК в вашем образце, представив горизонтальную линию, проходящую поперек полос маркера ДНК. Затем вы можете оценить размер ДНК в образце, сопоставив их с ближайшей полосой в маркере.

Иллюстрация, показывающая полосы ДНК, разделенные на геле.Длина фрагментов ДНК сравнивается с маркером, содержащим фрагменты известной длины. Изображение предоставлено: Genome Research Limited

Эта страница последний раз обновлялась 25.01.2016

.

Почему так важен гель-электрофорез?

Биология
Наука
  • Анатомия и физиология
  • Астрономия
  • Астрофизика
  • Биология
  • Химия
  • наука о планете Земля
  • Наука об окружающей среде
  • Органическая химия
  • Физика

Математика

.Гель-электрофорез нуклеиновой кислоты

- краткий обзор и история | Thermo Fisher Scientific

Гель-электрофорез - это распространенный лабораторный метод в молекулярной биологии для идентификации, количественного определения и очистки нуклеиновых кислот. Благодаря своей скорости, простоте и универсальности этот метод широко используется для разделения и анализа нуклеиновых кислот. Используя гель-электрофорез, нуклеиновые кислоты в диапазоне приблизительно 0,1-25 т.п.н. могут быть разделены для анализа в течение нескольких минут или часов, а разделенные нуклеиновые кислоты могут быть извлечены из гелей с относительно высокой чистотой и эффективностью [1,2].

Метод включает приложение электрического поля к смесям заряженных молекул, чтобы заставить их мигрировать, в зависимости от размера, заряда и структуры, через гелевую матрицу. Фосфатные группы рибозо-фосфатных скелетов нуклеиновых кислот заряжены отрицательно при pH от нейтрального до основного (, рис. 1A, ). Таким образом, каждый нуклеотид несет чистый отрицательный заряд, что означает, что общий заряд молекулы нуклеиновой кислоты пропорционален общему количеству нуклеотидов или ее массе.Другими словами, молекулы ДНК или РНК несут постоянное отношение заряда к массе. В результате их подвижность при гель-электрофорезе определяется в основном на основе размера, когда они имеют сопоставимую структуру (узнайте больше о том, как структура нуклеиновой кислоты влияет на миграцию). Следовательно, под действием электрического поля нуклеиновые кислоты мигрируют от отрицательного электрода (катода) к положительному электроду (аноду), причем более короткие фрагменты перемещаются быстрее, чем более длинные, что приводит к разделению в зависимости от размера (, рис. 1B, ).

Рис. 1. (A) Чистые отрицательные заряды, переносимые цепью нуклеиновой кислоты. (B) Разделение фрагментов нуклеиновых кислот различной длины в гель-электрофорезе.

Кроме того, расстояния миграции нуклеиновых кислот при гель-электрофорезе обычно показывают предсказуемую корреляцию с их размерами, что позволяет рассчитать размер нуклеиновых кислот в данном образце.Для линейных двухцепочечных фрагментов ДНК расстояние миграции обратно пропорционально логарифму молекулярной массы в определенном диапазоне (, рис. 2А, ) [3]. Для приблизительного определения размеров расстояния миграции обычно сравнивают с образцами, содержащими молекулы известных размеров (стандарты молекулярной массы, иногда называемые «лестницами»), которые часто включают в прогон геля. Широко принятая модель подвижности нуклеиновых кислот через гель - это «смещенная рептация» - миграция, смещенная в сторону приложенной электрической силы и включающая извилистое движение, когда передний край тянет за собой все остальное (, рис. 2В, ) [4,5].Эта модель была визуализирована с помощью флуоресцентной микроскопии [6].

Рисунок 2. Подвижность нуклеиновых кислот при гель-электрофорезе. (A) Корреляция размера и миграции линейных двухцепочечных фрагментов ДНК. (B) Модель предвзятого представления.

Верх

Использование электрофореза для разделения нуклеиновых кислот началось в начале 1960-х годов. В то время нуклеиновые кислоты обычно фракционировали центрифугированием в градиенте плотности на основе скоростей седиментации, которые определяются размером и конформацией нуклеиновых кислот.Центрифугирование в градиенте плотности потребовало значительного времени, тяжелого оборудования и большого количества образцов. В качестве альтернативы исследователи начали изучать характеристики подвижности ДНК в ионных или электролитических растворах при приложении электрического поля - процесс, названный электрофорезом [7,8].

В течение нескольких лет электрофорез нуклеиновых кислот превратился в использование гелевой матрицы в качестве среды для разделения, заимствуя технику, уже применяемую в электрофорезе белков.Агар (углевод естественного происхождения), агароза (компонент агара), полиакриламид (синтетический гель) и составные гели агароза-акриламид оказались успешными в качестве матриц для электрофореза ДНК и РНК в середине-конце 1960-х годов [ 9-11]. Результаты фракционирования из этих ранних экспериментов по гель-электрофорезу показали корреляцию с коэффициентами седиментации или значениями S , полученными центрифугированием в градиенте плотности, установленным в то время методом разделения нуклеиновых кислот.Благодаря лучшему пониманию и достижениям в производстве агарозы в конце 1960-х годов агароза постепенно заменила агар в качестве предпочтительной среды для гель-электрофореза [12].

Рисунок 3. Хронология раннего развития гель-электрофореза нуклеиновых кислот.

В 1970-х годах использование гель-электрофореза для разделения и анализа нуклеиновых кислот стало более распространенным с открытием рестрикционных ферментов и их применением в технологии рекомбинантных ДНК.Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, распространенный метод разделения в то время, включало громоздкие процессы и не могло адекватно отличить фрагменты ДНК аналогичного размера от рестрикционного переваривания. Вязкость раствора была использована эмпирически как индикатор успеха рестрикционного переваривания, поскольку расщепление ДНК от больших фрагментов к более мелким приводит к менее вязким растворам [13]. Клонирование фрагментов ДНК произвело революцию в 1971 году, когда Данна и Натанс впервые сообщили о калибровке рестрикционно-переваренных фрагментов ДНК SV40 с помощью электрофореза в полиакриламидном геле [14].Хотя агарозный и агарозно-полиакриламидный гели использовались для разделения РНК и одноцепочечной ДНК в конце 1960-х годов [15,16], работа по анализу рестрикционно-переваренных фрагментов с помощью электрофореза в агарозном геле не была опубликована до 1973 г. ( Рисунок 3 ) [17,18].

1970-е годы также стали прорывом в способах обнаружения нуклеиновых кислот с помощью гель-электрофореза. Ранние методы электрофореза основывались на радиоактивной маркировке нуклеиновых кислот для визуализации разделенных молекул.Несмотря на высокую чувствительность, протоколы радиоактивной маркировки длинны и требуют обучения в области радиационной безопасности. В 1972 году две лаборатории независимо друг от друга описали окрашивание геля флуоресцентной молекулой бромистого этидия (EtBr), которое стало распространенным и более простым методом обнаружения нуклеиновых кислот с чувствительностью в несколько нанограмм двухцепочечной ДНК [19–21]. Сегодня доступны флуоресцентные красители, которые более безопасны, чувствительны и специфичны, чем EtBr, улучшая обнаружение нуклеиновых кислот после гель-электрофореза.

Как и с появлением EtBr, гель-электрофорез стал более полезным с появлением пластинчатых гелевых форматов примерно в 1970 году, что привело к появлению вездесущего оборудования, которое мы видим сегодня. Ранее исследования с гель-электрофорезом проводились с использованием пробирок-гелей , отлитых в стеклянные пробирки диаметром 1–3 мм. Это был метод с очень низкой производительностью, поскольку каждая пробирка могла вместить только один образец (, рис. 4A, ). Вертикальные гели для пластин (, рис. 4B ), которые были намного проще в приготовлении и позволяли проводить одновременный анализ большего количества образцов, были впервые введены для полиакриламида в конце 1960-х и усовершенствованы Studier в начале 1970-х [22-24] .Горизонтальные плоские гели для агарозы (, рисунок 4C, ), аналогичные формату, используемому до сих пор, были впервые описаны McDonell et al. в 1977 г. [25]. Сегодня мини-сборные, готовые к использованию гели доступны как в полиакриламиде, так и в агарозе для более безопасного, быстрого и простого электрофореза в геле. Кроме того, в некоторых системах для гель-электрофореза используются готовые безбуферные гели, которые можно запустить всего за 10 минут. Их также можно комбинировать с цифровым изображением и анализом разделенных нуклеиновых кислот для более эффективного и удобного рабочего процесса.

Рис. 4. Распространенные форматы гелей для электрофореза.

В целом, гель-электрофорез стал универсальным методом в молекулярной биологии для разделения нуклеиновых кислот. Этот аналитический и препаративный метод не только является неотъемлемой частью обычных рабочих процессов, таких как молекулярное клонирование и ПЦР, но также играет важную роль для разделения и анализа нуклеиновых кислот в новых технологиях, таких как редактирование генома и секвенирование следующего поколения.

Верх

.

Гель-электрофорез - Science Learning Hub

Гель-электрофорез используется для разделения макромолекул, таких как ДНК, РНК и белки. Фрагменты ДНК разделяются по размеру. Белки можно разделить по размеру и заряду (разные белки имеют разные заряды).

Как разделяются фрагменты ДНК с помощью гель-электрофореза?

Раствор молекул ДНК помещается в гель. Поскольку каждая молекула ДНК имеет отрицательный заряд, ее можно протянуть через гель электрическим полем.Небольшие молекулы ДНК движутся через гель быстрее, чем более крупные молекулы ДНК.

В результате получается серия «полос», каждая из которых содержит молекулы ДНК определенного размера. Полосы, наиболее удаленные от начала геля, содержат мельчайшие фрагменты ДНК. Ближайшие к началу геля полосы содержат наиболее крупные фрагменты ДНК.

Когда гель-электрофорез используется для разделения фрагментов ДНК?

Гель-электрофорез может использоваться для различных целей, например:

Когда гель-электрофорез используется для разделения белков?

Благодаря телешоу, таким как CSI, многие люди знакомы с использованием гель-электрофореза для разделения макромолекул, таких как ДНК.Однако гель-электрофорез также можно использовать для разделения белков.

Различные белки имеют разные размеры, в основном из-за количества аминокислотных строительных блоков в их структуре. Химические модификации, связанные с белком, также влияют на его размер. У разных белков также разные заряды. Это может быть результатом как типов аминокислот, используемых для их создания, так и типов

.

Смотрите также